总氮量的测量-微量凯氏定氮法

        一、检测原理

        各种天然有机物的总含氮量通常用微量凯氏定氮法（ Micro - Kjeldahl Method）来测定。当被测的天然含氮有机物与浓硫酸共热时，被氧化为二氧化碳和水，而氮转变成氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵。为了加速有机物质的分解反应，在消化时常加入促进剂，硫酸铜可用作催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点，氧化剂如过氧化氢也能加速反应。

        消化完成后，在凯氏定氮仪中，加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。借水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准碱溶液进行滴定。根据所测得的氨量，计算样品的含氮量。

        在微量凯氏定氮法中，常用硼酸﹣指示剂混合液收集氨，氨与溶液中氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变。然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度，即指示剂变回原来颜色为止。所用无机酸的mmol 数即相当于样品中氨的mmol数。

        蛋白质是一类复杂的有机含氮化合物，其中每一种蛋白质都有其恒定的含氮量，大约在14%~18%，平均为16%。由凯氏定氮法测定出样品中的含氮量，再乘以系数6.25（即每含氮1g表示该样品含蛋白质6.25g)，便得样品所含蛋白质量。

若测定的蛋白质样品中尚含有其他含氮物质（称为非蛋白氮），为测得蛋白质的真实含量，应当向样品溶液中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，将蛋白质沉淀出来，再取样进行消化，测定蛋白氮，便可得到所测样品的蛋白质含量。

        本法适用范围约为0.2~1.0mg氮。相对误差应小于±2%。

        二、计算

           样品中含氮量（g氮%）=(A-B)×0.0100×14C×1000×100

           若测定的样品中含氮部分只是蛋白质时，则：

           样品中蛋白质含量（g%）=(A-B)×0.0100×14×6.25C×1000×100

           式中：A为滴定样品用去的盐酸平均ml数；B为滴定空白用去的盐酸平均ml数；C为称量样品的g数；0.0100为盐酸的mol浓度（要用实际标定浓度）；14为氮的相对原子质量；6.25为系数。

        三、试剂

        1,浓硫酸（分析纯）

        2,粉末硫酸钾﹣硫酸铜混合物（ K2SO4 : CuSO4·5H20=3:1、6:1或10:1)。也可使用80g硫酸钾，20g硫酸铜（CuSO4·5H2O）与0.3g二氧化硒或0.34g硒酸钠（Na2SeO4）充分研细混合的混合物。加少量氯化汞（约0.032g/ g 促进剂）可以加速赖氨酸和组氨酸的消化分解。

        3.30%( W / W ）氢氧化钠溶液

        4.2％硼酸溶液

        5.0.0100mol/ L 标准盐酸（要标定）

        6.混合指示剂（田氏指示剂）贮备液：取50mL0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1％甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。此指示剂在pH5.2为紫红色；pH5.4为暗蓝色（或灰色）;pH5.6为绿色。变色范围很窄，变色点pT为5.4，故混合指示剂很灵敏。

        7.硼酸﹣指示剂混合液：取100mL2％硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈紫红色即可（约加1mL混合指示剂贮备液）。

        8.标准硫酸铵溶液（0.3mg氮／mL )。取141.6mg分析纯硫酸铵，加水溶解，定容至100ml。

        9.待测蛋白质样品

        四、器材

        1.凯氏烧瓶                        2.消化架

  3.水泵                               4.凯氏定氮蒸馏装置

        5.锥形瓶                           6.容量瓶

  7.吸量管                           8.表面皿

  9.微量滴定管（5ml，可读准0.01ml）  

  10.煤气灯或电炉              11 .小量筒